【编者按】在我国，酿酒酵母菌株的单细胞代谢功能分析历史很长，但是将万亿细胞数量级的“酵母产品”作为一个宏观整体在实际应用层面做实验分析，在国内一直鲜有人做，酵富团队希望用客观真实的数据，为国内的酿酒同行、爱好者提供一个前所未有的角度来寻找啤酒酿造配方工艺的改进之路。
【酵真Research】栏目是酵富实验室开设的一个围绕啤酒酿造原料改进，工艺技术优化为目标的科普论坛，探讨遵循客观真实，科学论证的原则，欢迎业内同行，产业专家审阅，数据，信息若有疏漏，歧义，恳请斧正，文末有联系方式。
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【No.1 酵母发酵表现差异化定量分析（上篇）】本次研究，试图量化分析不同形态（液体vs干粉），不同菌种（来自不同品牌）的德式小麦酵母，在发酵前的活力活性差异，和发酵后的产物差异。
【正文】作为啤酒的灵魂，相信大家对于酵母是非常熟悉的。酵母的使用形态非常多种，而"液态"是酵母在所有的产品形态中最原始的一种，此时的酵母有着更为天然且健康的活性。在现今的啤酒酿造行业中，大家普遍使用的酵母形态还是以干粉为主，干粉酵母有着较长的保质期以及极高的酵母数，相较之下，因为液体酵母时刻保持着新鲜的状态，因此保质期相对短一些，价格也较高。
液体酵母和干粉酵母都有着彼此的优缺点，那么他们究竟有什么差异呢?
我们可以从两种层面探讨其中的奥妙，之一种是利用市面上常见的同功能酵母(包含液体和干粉)，将这些酵母采用平行的发酵测试，直接比较液体和干粉酵母菌株的发酵表现，第二种方法可以一支酵母菌株同时制备成液体和干粉的形态，分别进行发酵测试。
这次，我们先采用了之一种方法，比较了市面上较为常见的德式小麦酵母菌株，从中探讨这几株液体和干粉酵母菌株在发酵表现上是否有什么差异。
【本次研究所比对的不同酵母菌株产品信息】
首先，我们将从以下几个层面来探讨其中的差异:酵母的活性差异: 我们知道干粉酵母在制造的过程中，可能会使细胞处于脆弱不健康的状态，然而具体的比例是多少呢? 和液体酵母比起来，酵母细胞的活性又有多大的差异呢? 我们将透过染色的方式来观察酵母的活性，实验中我们分别利用了*蓝(Methylene blue)和荧光染色(FDA/PI)两种方法来观察液体和干粉酵母的活性差异。发酵过程中的差异: 在干粉酵母的使用上，可以直接将干粉投入麦汁中，也可以将干粉酵母先透过复水活化提高酵母的活性，之后再投入麦汁，那么，经过复水活化的干粉酵母和液体酵母在发酵表现上会有什么差异吗? 本次实验，我们透过先前的活性酵母计数，将干粉和液体酵母控制在相同的投放比例(450万个细胞/mL)，于同一个批次的4 L麦汁中，22°C发酵一周，期间观察酵母的降糖速度。成品酒中风味物质的差异: 成品酒的风味应该是一项相对直观的指标，酿酒师们应该都会关心，我们所使用的酵母究竟能不能使啤酒的风味达到预期? 因此，我们也将发酵测试的成品酒进行风味物质的分析，观察分别使用三株干粉酵母和一株液体酵母的成品啤酒风味上是否存在着差异。【干粉酵母活性测定和复水活化】
活性测定- 于无菌操作台中取出少量干粉酵母至50 mL离心管中，加入适量0.85%生理食盐水进行均质，之后将全部酵母泥加入5 L血清瓶中，再以4°C的0.85%生理食盐水进行约500倍的稀释，最后将酵母稀释液与0.01%*蓝染色液以1:1的比例均匀混合，取样至血球计数板上，以400X的倍率进行计数，计数区域中的白色细胞计为活细胞，而蓝色细胞则计为死细胞或受损细胞，以此方法求得干粉酵母中的总酵母密度和活性酵母密度。复水活化- 分别根据厂家指示的更佳复水步骤，以达到更佳的酵母状态。
F06-将干粉酵母投入10倍体积的25°C生理食盐水(0.85% saline)中，静置30分钟，温柔搅拌将酵母充分混匀，并且直接投入麦汁中。
LMC-将干粉酵母投入10倍体积的30°C生理食盐水(0.85% saline)中，温柔的搅拌，静置15分钟，将酵母充分混匀，再于30°C静置5分钟，接着直接投入麦汁中。
MJ20-将干粉酵母投入10倍体积的30°C生理食盐水(0.85% saline)中，温柔的搅拌使其变成酵母泥，维持12分钟，接着直接投入麦汁中。
在酵母活性检测结果中，F06(上图A)、LMC(上图B)和MJ20(上图C)干粉酵母经过复水活化后，从普通光学显微镜检测结果中可以发现酵母活性提高了许多，大约都能提升至80%以上。
【备注】此处使用的"酵母活性"并不等同于"酵母存活率"。在*蓝的染色结果中，未经过复水活化的干粉酵母活性根据不同的厂家大概介于40-80%之间，此时染上蓝色的酵母细胞并不一定是死亡状态，部份只是处于细胞受损的状态，因此复水活化后，酵母细胞经过修复，活性均能明显提高。
相较于干粉酵母，JFA1410有更高的活性98.8%，细胞形态也更为饱满，处于非常健康的状态(上图)。
【备注】除了以普通光学显微镜检测活性，我们也使用了荧光细胞计数仪LUNA-II YF观测干粉酵母复水前后的差异，分别透过Fluorescein Diacetate(FDA)染剂和Propidium Iodide(PI)染剂更能够体现出酵母的活性。FDA是一种能够穿透过细胞膜的染剂，酵母内部的酯酶(Esterase)能够将其水解，之后经过激发会呈现出绿色荧光；PI则是一种无法进入活细胞的染剂，然而可以穿透过死酵母或是受损酵母细胞膜的染剂，并且和细胞中的核酸结合，透过激发呈现红色荧光。
上图分别为F06(A)、LMC(B)、MJ20(C)和JFA1410(D)的LUNA-II YF酵母活性检测结果，透过荧光标记能够明显看出酵母活性高低的比例(绿色为活细胞，红色为死细胞或是受损细胞)，如同普通光学显微镜的观测结果，三株干粉酵母(F06、LMC和MJ20)在未经过复水活化时，有较高的死酵母或受损酵母比例，复水后酵母活性均能明显提高，而液体酵母JFA1410在荧光标记中也能看出有相当高的细胞活性。
【发酵表现的平行测试】我们采用了经典德式小麦(详情可参阅酵富实验室-德式小麦配方)。为达到相同的初始酵母数(450万个细胞/mL)，我们参考四株酵母菌的活细胞率分别计算出酵母的使用量。于开始发酵的0小时起，每24小时取一次样，测定发酵液的糖度，建构4株德式小麦酵母菌的降糖曲线。
在发酵过程中，从降糖曲线可以看出JFA1410在启发速度方面是快于三株干粉酵母的，发酵16小时后已进入明显的高泡期(下图)，从降糖曲线中我们可以观察到JFA1410在发酵24小时后已达到了约40%的发酵度，三株干粉酵母(F06、LMC和MJ20)的发酵速度相较于JFA1410大约慢了18-24小时。
【风味物质分析】下一步我们分析了四株酵母菌成品酒中的风味物质含量是否有差异，将成品酒送样委托第三方机构采用气相色谱仪分析风味物质含量。在德式小麦啤酒的风味中，以香蕉、丁香风味最为突出，其中香蕉、泡泡糖香气主要由*、*所提供，而丁香风味则是由酚类物质所带来的。
因此，我们特别关注了*和*的含量，干粉酵母F06和液体酵母JFA1410有着较为接近的*含量，相较于LMC和MJ20多出了大约28%；而香蕉风味的主要来源-*含量分析中，JFA1410几乎是三株干粉酵母的2倍之多。
为了让这些数据更加的直观，我们尝试将这些风味制作成雷达图。以各项风味物质的阈值为基准，将测定出的风味物质含量扣除阈值，再除以阈值得到一项风味分数，并且将各项风味分数进行叠加，得到最终的整体香气分数，以此分数制作雷达图。
因为风味物质所体现的香味相对主观，本次实验根据相关文献(Olaniran, Hiralal et al. 2017)中所描述各项风味物质体现出的香气来制作风味雷达图。从下图可以看出三种干粉酵母的风味分布大小十分相似，而JFA1410的风味雷达图则体现出了较强的风味，突出了更明显的香蕉香气。(本次实验并无分析酚类物质，因此没有比较丁香风味差异的数据)
【结语】从本次实验的结果我们可以发现，液体酵母JFA1410相较于干粉酵母有着更高的活性，并且能于发酵成品中体现出更强的风味，三株干粉酵母虽然初始酵母活性较低，但是藉由更高的酵母密度透过复水活化仍能提高整体的活性。
然而，复水活化后的活酵母数根据每次的活化程度可能会有所差异，造成发酵初始活酵母数的不一致，使酿酒师无法准确操控酵母的接种比例，导致每次的发酵表现具有不稳定性，而液体酵母使用上的缺点则为保质期较短，超过保质期的液体酵母活性会逐渐衰减，但若是使用保质期内的液体酵母，则能够精准的控制酵母投放比例，并且更大程度的发挥酵母发酵特性，为啤酒发酵表现的一致性提供保证。
【下集预告】如同开篇所言，此次酵母产品的比较分析还有另一个维度，即“将一支酵母菌株同时制备成液体和干粉的形态，分别进行发酵测试”，该实验正在进行中，下篇《酵真 Research 》将做详细汇报。
【参考文献】Olaniran, A. O., et al. (2017). "Flavour‐active volatile compounds in beer: production, regulation and control." Journal of the Institute of Brewing 123(1): 13-23.
【关于“酵富”】
“酵富实验室”位于南京市江北新区智能制造产业园，是国内知名的专业啤酒液体酵母及酿造解决方案提供商。核心成员由：医学微生物博士，农学微生物硕士，IT软件开发工程师，IT硬件设计工程师，发酵领域质量专家，食品工程专业出身的酿酒师，曾经活跃在歌剧舞台但热爱酿造艺术的专家等极客组成。凭借对啤酒酿造的热爱和酵母遗传学的尊重，酵富团队以极大热情投入到优质酵母菌株的捕获筛选，传代培育工作中去。
【研发团队的核心竞争力】
建立菌种培育数据库，并持续优化培育的能力
分子级鉴定水准，保证菌种健康传代的能力
独立采集，分离，鉴定野生，驯化菌种的能力
通过设计酿造科学实验，验证不同菌种发酵表观性能
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